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生信篇 | Unicycler實戰(zhàn)指南：駕馭二代與三代測序組裝全流程

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時間: 2025-04-21 | 153 次瀏覽 | 分享到:

Unicycler是專為細(xì)菌基因組設(shè)計的組裝工具，既支持純二代(Illumina)或純?nèi)?Nanopore/PacBio)數(shù)據(jù)，也擅長混合組裝。它融合了 De Bruijn 圖（適用于短讀段）和字符串圖（String Graph，適用于長讀段）兩種策略，兼顧準(zhǔn)確性與連續(xù)性。上一期我們詳細(xì)介紹了Unicycler在混合組裝中的應(yīng)用，這期我們將帶來Unicycler單獨進行二代與三代組裝的應(yīng)用。

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Unicycler工作原理詳解


二代數(shù)據(jù)組裝流程

  • 圖構(gòu)建：拆分短序列為k-mer（默認(rèn)k=21/33/55），構(gòu)建 De Bruijn 圖，通過尋找歐拉路徑生成初步contig；

  • 糾錯優(yōu)化：借助 SPAdes 算法改良，結(jié)合橋接(bridging)與覆蓋過濾，解決重復(fù)區(qū)段問題，提高組裝連貫性。


三代數(shù)據(jù)組裝流程

  • 初步組裝：基于 Miniasm 快速構(gòu)建重疊圖；

  • 多輪校正：默認(rèn)結(jié)合 Racon 進行3輪錯誤校正；

  • 自動閉環(huán)：識別染色質(zhì)/質(zhì)粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)，輸出完整閉環(huán)序列。

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操作流程與參數(shù)解析


數(shù)據(jù)準(zhǔn)備要求

  • 二代數(shù)據(jù)：雙端FASTQ文件，推薦覆蓋度≥50x；

  • 三代數(shù)據(jù)：FASTQ/FASTA格式，推薦N50≥10kb，覆蓋度≥30x。


常用命令示例

場景一：僅用二代數(shù)據(jù)組裝

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  • --mode：組裝模式（normal/bold/conservative）；

  • --min_fasta_length：設(shè)定輸出Contig的最小長度。

場景二：僅用三代數(shù)據(jù)組裝

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  • --keep：保留中間文件，便于后續(xù)調(diào)試與評估；

  • –min_polish_size：只對 ≥10 kb 的contig進行拋光。

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實戰(zhàn)演練：E.coli基因組組裝


數(shù)據(jù)信息

  • 樣本：大腸桿菌E.coli K-12，基因組大小約4.6Mb；

  • 測序平臺：

二代：Illumina NovaSeq PE150，覆蓋度100x；

三代：Nanopore PromethION，N50=15 kb，覆蓋度50x。


運行示例

二代數(shù)據(jù)：

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輸出文件：

assembly.fasta：最終組裝序列（含環(huán)化信息）；

assembly.gfa：組裝圖文件，可用Bandage可視化。

三代數(shù)據(jù)：

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若N50偏低，可加大 --racon_iterations 5以提高拋光輪次。

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結(jié)果評估與優(yōu)化建議


核心評估指標(biāo)

  • Contig N50：理想值應(yīng)接近全基因組長度（~4.6 Mb）；

  • 閉環(huán)比例：檢查 assembly.fasta 中 circular=true 標(biāo)簽；

  • BUSCO 完整性：目標(biāo)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫中完整度 ≥95%。


常見問題及處理建議

  • Contig 碎片化：

二代：增加測序深度，調(diào)整 --min_kmer_coverage；

三代：嘗試提高 --min_overlap（如設(shè)為5000）。

  • 嵌合體污染：使用BLAST或MUMmer對比參考基因組，排查異常區(qū)域。

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總結(jié)

在這兩期推文中，我們詳細(xì)介紹了 Unicycler 在微生物基因組組裝中的應(yīng)用場景、核心原理與實操策略，涵蓋了 Illumina 與 Nanopore 等不同平臺的組裝優(yōu)化方案。Unicycler 憑借其對 De Bruijn 圖與字符串圖的融合設(shè)計，以及自動糾錯與環(huán)化輸出機制，在原核基因組研究中表現(xiàn)出色。

后續(xù)我們將陸續(xù)推出以下專題，幫助大家從入門到進階掌握二代/三代測序分析技能：

  • 三代數(shù)據(jù)質(zhì)控與糾錯工具詳解（如 Filtlong、NanoFilt、Racon、Medaka）

  • 宏基因組組裝與 binning 技術(shù)實戰(zhàn)

  • 基于圖的可視化分析工具（Bandage、IGV、Tablet）

  • 長短讀混合組裝工具對比（如 Flye、HybridSPAdes、MaSuRCA 等）

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