微小核糖核酸(MicroRNA)，又簡稱miRNA，是一類由動物、植物、病毒基因組編碼的內(nèi)源性的、非蛋白編碼的小RNA，一般由19-25個核苷酸構(gòu)成。microRNA在生命活動的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，例如細(xì)胞增殖、分化和凋亡。其中microRNA-122-5p(miR-122-5p)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，研究表明在胃癌和乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-122-5p會抑制細(xì)胞的生長、侵襲和遷移，miR-122-5p主要發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-122-5p 在黑色素瘤血清中異常高表達(dá)，提示其在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

美國FDA科學(xué)家Shi Q在2013年撰文深入論述了血液microRNA，尤其是miRNA -122作為肝損害生物學(xué)指標(biāo)，具有顯著優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)志物丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的臨床應(yīng)用前景，但也存在無標(biāo)準(zhǔn)化的定量檢測方法的問題。美國FDA在2015年8月20日發(fā)布了有關(guān)生物標(biāo)志物的報(bào)告，認(rèn)定miRNA-122作為臨床亟需(Critical Need)的急性肝毒性安全生物標(biāo)志物（非臨床和臨床），可應(yīng)用于藥物肝臟毒性的證明性研究、臨床劑量遞增的安全性研究及藥物誘發(fā)的肝損傷3種情況。

鑒于血漿mir-122-5p定量檢測的重要應(yīng)用前景，柏創(chuàng)翌自主開發(fā)了一套基于數(shù)字PCR平臺的mir-122-5p檢測體系。下面介紹一下整個工作流程，包括血液采集、血漿處理、冷凍儲存、miRNA分離、逆轉(zhuǎn)錄、液滴生成、PCR擴(kuò)增、熒光讀取和數(shù)據(jù)分析。

首先，由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員收集5ml外周靜脈血，將其放入EDTA抗凝管中。采集后，立即將血樣管倒置數(shù)次，直至完全混合，4℃保存不超過2小時。常溫條件下，應(yīng)立即將采集的血樣在室溫下2500 × g離心15分鐘。收集上清，并將其轉(zhuǎn)移到無菌、無核酸酶的15ml錐形管中。將轉(zhuǎn)移的上清在室溫下10000 × g離心15分鐘，進(jìn)一步純化并去除細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到一個新的15ml錐形管中。分離后血漿可在- 80°C下保存兩年。

我們使用某款商業(yè)化的血漿提取試劑盒分離RNA。實(shí)驗(yàn)方案按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取結(jié)束立即進(jìn)行RNA定量。

使用本公司研發(fā)設(shè)計(jì)的特異性miR-122-5p莖環(huán)引物，與某進(jìn)口品牌TaqMan? MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，共同將目的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)方案按照試劑盒說明書進(jìn)行。

首先以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物為模板，加入本公司研發(fā)設(shè)計(jì)的miR-122-5p PCR引物探針混合液，以及BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)配制20μLPCR反應(yīng)液。

然后，將配制好的20μL PCR反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡(DG8 cartridge)sample孔中，再加入70μL微滴發(fā)生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200TM微滴式數(shù)字PCR儀的微滴生成器制備反應(yīng)微滴。每個微滴發(fā)生卡一次可同時完成8個樣品的微滴制備，用時約2.5 min。

將每個樣品的微滴分別轉(zhuǎn)移至96孔PCR反應(yīng)板中對應(yīng)的反應(yīng)孔中，用鋁膜熱封(180℃，5sec)后，于普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增是在Bio-Rad T100 PCR儀上完成的，溫度程序見Table 1。

Check/adjust ramp rate settings to 2 ℃/sec. Use a hearted lid set to 105 ℃ and set the sample volume to 40 μl

將PCR擴(kuò)增后的96孔板放入微滴式數(shù)字PCR儀的微滴分析器中，儀器自動分析每個樣品的每個微滴中熒光信號，然后，由QuantaSoft完成對數(shù)據(jù)的自動處理，獲得靶序列在PCR反應(yīng)體系中的拷貝數(shù)濃度（單位：copies/μL）。

空白檢出限：

準(zhǔn)備10例陰性對照cel-miR-39-3p-2樣本，10例NTC樣本做模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用優(yōu)化后的檢測體系進(jìn)行檢測，cDNA上樣量1μL。用泊松分布概率函數(shù)統(tǒng)計(jì)檢測到假陽性微滴的累計(jì)頻率（即假陽性率）。計(jì)算臨床陽性判讀閾值。

該檢測體系空白檢出限為當(dāng)FAM通道≥11個陽性微滴判讀陽性。此時檢測體系檢測陽性微滴真實(shí)性＞99%。

精密度：

陽性對照樣本hsa-miR-122-5p-2樣本反轉(zhuǎn)錄后，cDNA上樣量1μL，檢測10次重復(fù)，由此求出批內(nèi)精密度CV（%）值9.78%，小于15%，符合預(yù)設(shè)技術(shù)指標(biāo)，檢測體系精密度良好。

線性靈敏度：

hsa-miR-122-5p-2樣本反轉(zhuǎn)錄，cDNA按5倍梯度稀釋，上樣體積1μL，做5個濃度梯度，每個梯度5復(fù)孔。以CV值小于20%的最低稀釋梯度定為該檢測體系靈敏度，因此該檢測體系靈敏度定為26.8拷貝。

以5個梯度作出線性回歸圖，以稀釋度為橫軸，每個稀釋度的測量值均值為縱軸作出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)平方，R2＞0.99時視為線性相關(guān)性良好。

準(zhǔn)確度：

檢測8例真實(shí)樣本，反轉(zhuǎn)錄總體系15ul、RNA用量5ul、PCR上樣量1.33ul，使用自主開發(fā)的檢測體系與某進(jìn)口品牌檢測體系同步對比，對比檢測結(jié)果?？截悢?shù)值80%以上趨勢一致，準(zhǔn)確性良好。

ddPCR圖片展示：

微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)被稱為第三代PCR技術(shù)，由于在人體例如血漿、尿液等體液中的miRNA分子豐度普遍不高，而數(shù)字PCR由于其在微量檢測技術(shù)上的重大創(chuàng)新和突破，目前已成為液體活檢中認(rèn)知度最高的技術(shù)手段。柏創(chuàng)翌生物配備了國際一流的數(shù)字PCR技術(shù)平臺：伯樂微滴式數(shù)字PCR(QX200、QX600)，希望能為客戶提供優(yōu)質(zhì)的miRNA定量檢測服務(wù)。